Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Вторая стадия включает количественное определение образовавшегося фактора Ха с использованием специфичного в отношении фактора Ха хромогенного субстрата. Обычно он представляет собой короткий пептид, состоящий из 3-5 аминокислотных остатков, присоединенный к хромофорной группе. При отщеплении этой группы от пептидного субстрата ее хромофорные свойства смещаются к длине волны, при которой становится возможным произвести спектрофотометрическое определение. Субстрат обычно растворяют в воде R и используют в конечных концентрациях 0,2-2 ммоль/л. Субстрат также может содержать подходящие ингибиторы для прекращения дальнейшего образования фактора Ха (добавка эдетата).
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Восстанавливают полное содержимое одной ампулы препарата сравнения и испытуемого препарата путем добавления подходящего количества воды R; используют в течение 1 часа. Восстановленные препараты дополнительно разбавляют прерастворителем, получая растворы с содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл фактора VII.
Готовят дальнейшие разведения испытуемого и стандартного препаратов с использованием изотонического нехелатирующего буфера, содержащего 1% человеческого или бычьего альбумина и предпочтительно буферизированного при рН от 7,3 до 8,0. Готовят не менее трех отдельных, независимых разведений каждого препарата. Предпочтительно каждое из разведений готовить в двух повторностях. Разведения готовят таким образом, чтобы окончательная концентрация фактора VII была ниже 0,005 МЕ/мл.
Готовят контрольный раствор, включающий все компоненты, кроме фактора
VII.
Все разведения готовят в пластиковых пробирках и используют в течение 1 часа.
1-я стадия. Разведения образца сравнения фактора VII и испытуемого препарата смешивают с подходящим объемом предварительно нагретого реагента факторов свертывания крови или со смесью реагентов, его составляющих, и инкубируют смесь в пластиковых пробирках или ячейках планшета при температуре 370С. Концентрации компонентов в процессе образования фактора Ха должны соответствовать спецификациям, приведенным выше, при описании реагентов.
Активацию фактора Х проводят в течение подходящего промежутка времени, предпочтительно прерывая реакцию до достижения концентрацией фактора Ха ее максимального уровня с целью получения удовлетворительной линейной
зависимости отклика от дозы. Время активации выбирается также таким образом, чтобы достичь линейного во времени образования фактора Ха. Подходящие периоды активации обычно находятся в пределах от 2 до 5 минут, но допускаются и другие значения при условии получения таким образом приемлемой линейности зависимости отклика от дозы.
2-я стадия. Активацию прерывают добавлением предварительно нагретого
реагента, содержащего хромогенный субстрат. Проводят количественную оценку скорости расщепления субстрата, которая должна находиться в линейной
зависимости от концентрации образовавшегося фактора Ха, измеряя изменение
оптической плотности при соответствующей длине волны с помощью
спектрофотометра. Оптическую плотность отслеживают постоянно, получая таким образом возможность вычислить начальную скорость расщепления субстрата, либо прерывают реакцию гидролиза по окончании подходящего промежутка времени путем понижения рН добавлением подходящего реагента, например, уксусной кислоты (500 г/л С2Н4О2) или раствора цитрата (1 моль/л) с рН 3. Время гидролиза регулируют с целью достижения линейного характера образования хромофора во времени. Подходящими обычно являются периоды гидролиза от 3 до 15 минут, но допускаются и другие значения при условии получения таким образом лучшей линейности зависимости отклика от дозы.
Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).
2.7.11. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IX
Активность определяют путем сравнения количества испытуемого препарата, необходимого для уменьшения времени свертывания испытуемой смеси, содержащей вещества, отличные от фактора IX, принимающие участие в процессе коагуляции, и количества препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для получения такого же эффекта.
За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата фактора свертывания крови человека IX. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Восстанавливают по отдельности испытуемый препарат и препарат сравнения в соответствии с указаниями на этикетке и используют немедленно. В случае необходимости, определяют количество присутствующего гепарина (2.7.12) и нейтрализуют гепарин добавлением протамина сульфата R (10 мкг протамина сульфата нейтрализуют 1 МЕ гепарина). Испытуемый препарат и препарат сравнения разбавляют количеством имидазольного буферного раствора рН 7,3 R, достаточным для получения растворов с содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл. Готовят двукратные разведения в диапазоне от 1:10 до 1:80 с использованием смеси 1 объема раствора натрия цитрата R концентрацией 38 г/л и 5 объемов имидазольного буферного раствора рН 7,3 R. Разведения производят с высокой точностью и используют немедленно.
